Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 4: Tái bản DNA

Đăng ngày 10/17/2019 3:59:57 AM | Thể loại: | Lần tải: 0 | Lần xem: 5 | Page: 19 | FileSize: 1.12 M | File type: PDF
Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 4: Tái bản DNA. Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 4: Tái bản DNA. Nội dung chính được trình bày trong chương này gồm có: Chứng minh tái bản DNA theo cơ chế bán bảo thủ, mô hình tái bản DNA - chạc ba tái bản, bản chất xoắn của DNA - các giai đoạn của sự tái bản, khái niệm mồi.
Chương 4
Tái bản DNA
I. Chứng minh tái bản DNA theo chế bán bảo thủ
1. chế tái bản bán bảo thủ
1.1. Cơ chế tái bản ở prokaryote
Đặc điểm cơ bản của sự tái bản đó là tái bản theo phương thức bán
bảo thủ (semiconservative replication). Tái bản bán bảo thủ nghĩa là trong
hai chuỗi của tất cả các phân tử DNA bao giờ cũng có:
- Một chuỗi của DNA cũ (từ một trong hai chuỗi của DNA mẹ).
- Một chuỗi của DNA mới (mới được tổng hợp).
Mỗi một lần tái bản đều có sự tách rời của hai chuỗi của DNA mẹ,
đồng thời mỗi chuỗi mẹ tiến hành sao chép để cho một chuỗi con, chuỗi này
sau đó lại kết hợp với chuỗi mẹ.
Vị trí mở xoắn kép và tổng hợp DNA mới cùng một lúc trên DNA gọi
chạc ba tái bản (replication fork) do cấu trúc của vùng tái bản có hình chữ
Y. Sự tổng hợp DNA mới gắn liền với việc mở xoắn DNA cũ.
1.2. Cơ chế tái bản ở eukaryote
Sự tái bản ở tế bào eukaryote phức tạp hơn so với ở tế bào prokaryote
nhưng cơ chế của sự tái bản ở eukaryote cũng tương tự như ở prokaryote và
tiến hành theo các nguyên tắc:
- Hai hướng.
- Bổ sung, đối song song, theo chiều 5’
3’.
- Không liên tục ở một trong hai chuỗi.
- Cần những RNA primer.
Tuy nhiên, có một số điểm khác như sau:
- Trong khi ở prokaryote chỉ có một điểm khởi đầu, thì sự tái bản ở
eukaryote bắt đầu cùng một lúc ở nhiều điểm khởi đầu. Điều này là cần thiết
do DNA của eukaryote có chiều dài rất lớn.
- Vận tốc phát triển của chạc ba tái bản ở eukaryote (khoảng 50
nucleotide/s) chỉ bằng 1/10 so với ở E. coli.
Sinh học phân tử
76
2. Thí nghiệm của Meselson Stahl
Những thí nghiệm của Meselson và Stahl (1957) đã chứng minh lý
thuyết tái bản DNA theo kiểu bán báo thủ (Hình 4.1). Các tác giả trên đã
nuôi cấy E. coli trong nhiều thế hệ trong một môi trường chứa 15NH4Cl làm
nguồn cung cấp nitrogen duy nhất. Bằng cách này, DNA được tổng hợp có
15N (15N là một chất phóng xạ nặng hơn chất phóng xạ thông thường 14N). Ở
một thời điểm nhất định (thời điểm 0), các tác giả này đã chuyển nuôi cấy
vào một môi trường chứa 14NH4Cl. Tiếp đến, sau từng thời gian đều đặn, họ
phân tích DNA chiết xuất từ
vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm theo
gradient CsCl.
DNA được tách chiết và
ly tâm để cân bằng theo
grandient mật độ CsCl
Các phân tử
bố mẹ gốc
DNA nặng (15N)
H
H
Chuỗi mới
Chuỗi mẹ
Các phân tử con
DNA lai (15N/14N)
thế hệ thứ nhất
H
L
L
H
DNA nhẹ (14N)
Các phân tử con
DNA lai
thế hệ thứ hai
L
L
H
L
L
H
L
L
Hình 4.1. Minh họa sự tái bản bán bảo thủ. Sơ đồ trình bày sự hợp thành các sợi
đôi DNA sau 0, 1, và 2 vòng sao chép. H: chuỗi nặng (15N), L: chuỗi nhẹ (14N).
Kết quả thực nghiệm cho thấy:
- Ở thời điểm 0: chỉ có một phân tử tương ứng với DNA nặng 15N.
Sinh học phân tử
77
- Sau một thế hệ trong môi trường chứa 14N: những phân tử DNA gồm
một chuỗi nặng 15N (chuỗi mẹ) và một chuỗi nhẹ 14N (mới được tổng hợp).
- Sau hai thế hệ trong môi trường chứa 14N: có hai phân tử lai (gồm
một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ) và hai phân tử đều gồm những chuỗi nhẹ
không có chuỗi nặng.
II. hình tái bản DNA-chạc ba tái bản
1. hình tái bản
Mô hình tái bản được nghiên cứu trên thể nhiễm sắc của vi khuẩn E.
coli, DNA có dạng mạch vòng sợi đôi (Hình 4.2). Để tự tái bản DNA phải
tháo ra đơn giản ở một vị trí nhất định và nơi đó xuất hiện chạc ba tái bản
(Hình 4.3).
Thí nghiệm của Cairns. Sử dụng nucleotide được đánh dấu bằng
đồng vị phóng xạ trong môi trường đang phân chia, ta sẽ biết được tiến trình
tái bản do hạt bạc xuất hiện dưới kính hiển vi điện tử.
Sợi đôi
của con
Sợi đôi
của bố mẹ
Hình 4.2. DNA dạng mạch vòng sợi đôi. Chiều dài thực tế 1,6 mm (4,7×106 bp).
2. Chạc ba tái bản
Hình 4.4 mô tả cấu trúc của chạc ba tái bản. Nhờ vào phương pháp
phóng xạ ảnh tự ghi, người ta nhận thấy sự tái bản thực hiện theo hai hướng
(bidirectional synthesis). Đồng thời cũng chứng minh được vi khuẩn E. coli
(prokaryote) có duy nhất một điểm gốc tái bản, đó là điểm mà hai chuỗi
xoắn kép của DNA mẹ được tách ra, tương ứng với hai chạc ba tái bản phát
triển ngược chiều nhau. Chuỗi DNA sau khi tách ra được dùng làm khuôn
mẫu cho sự tổng hợp DNA mới (Hình 4.5).
Sinh học phân tử
78
HƯỚNG DẪN DOWNLOAD TÀI LIỆU

Bước 1:Tại trang tài liệu slideshare.vn bạn muốn tải, click vào nút Download màu xanh lá cây ở phía trên.
Bước 2: Tại liên kết tải về, bạn chọn liên kết để tải File về máy tính. Tại đây sẽ có lựa chọn tải File được lưu trên slideshare.vn
Bước 3: Một thông báo xuất hiện ở phía cuối trình duyệt, hỏi bạn muốn lưu . - Nếu click vào Save, file sẽ được lưu về máy (Quá trình tải file nhanh hay chậm phụ thuộc vào đường truyền internet, dung lượng file bạn muốn tải)
Có nhiều phần mềm hỗ trợ việc download file về máy tính với tốc độ tải file nhanh như: Internet Download Manager (IDM), Free Download Manager, ... Tùy vào sở thích của từng người mà người dùng chọn lựa phần mềm hỗ trợ download cho máy tính của mình  
5 lần xem

Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 4: Tái bản DNA. Bài giảng Sinh học phân tử - Chương 4: Tái bản DNA. Nội dung chính được trình bày trong chương này gồm có: Chứng minh tái bản DNA theo cơ chế bán bảo thủ, mô hình tái bản DNA - chạc ba tái bản, bản chất xoắn của DNA - các giai đoạn của sự tái bản, khái niệm mồi..

Nội dung

Chương 4 Tái bản DNA I. Chứng minh tái bản DNA theo cơ chế bán bảo thủ 1. Cơ chế tái bản bán bảo thủ 1.1. Cơ chế tái bản ở prokaryote Đặc điểm cơ bản của sự tái bản đó là tái bản theo phương thức bán bảo thủ (semiconservative replication). Tái bản bán bảo thủ nghĩa là trong hai chuỗi của tất cả các phân tử DNA bao giờ cũng có: - Một chuỗi của DNA cũ (từ một trong hai chuỗi của DNA mẹ). - Một chuỗi của DNA mới (mới được tổng hợp). Mỗi một lần tái bản đều có sự tách rời của hai chuỗi của DNA mẹ, đồng thời mỗi chuỗi mẹ tiến hành sao chép để cho một chuỗi con, chuỗi này sau đó lại kết hợp với chuỗi mẹ. Vị trí mở xoắn kép và tổng hợp DNA mới cùng một lúc trên DNA gọi là chạc ba tái bản (replication fork) do cấu trúc của vùng tái bản có hình chữ Y. Sự tổng hợp DNA mới gắn liền với việc mở xoắn DNA cũ. 1.2. Cơ chế tái bản ở eukaryote Sự tái bản ở tế bào eukaryote phức tạp hơn so với ở tế bào prokaryote nhưng cơ chế của sự tái bản ở eukaryote cũng tương tự như ở prokaryote và tiến hành theo các nguyên tắc: - Hai hướng. - Bổ sung, đối song song, theo chiều 5’ 3’. - Không liên tục ở một trong hai chuỗi. - Cần những RNA primer. Tuy nhiên, có một số điểm khác như sau: - Trong khi ở prokaryote chỉ có một điểm khởi đầu, thì sự tái bản ở eukaryote bắt đầu cùng một lúc ở nhiều điểm khởi đầu. Điều này là cần thiết do DNA của eukaryote có chiều dài rất lớn. - Vận tốc phát triển của chạc ba tái bản ở eukaryote (khoảng 50 nucleotide/s) chỉ bằng 1/10 so với ở E. coli. Sinh học phân tử 76 2. Thí nghiệm của Meselson và Stahl Những thí nghiệm của Meselson và Stahl (1957) đã chứng minh lý thuyết tái bản DNA theo kiểu bán báo thủ (Hình 4.1). Các tác giả trên đã nuôi cấy E. coli trong nhiều thế hệ trong một môi trường chứa 15NH4Cl làm nguồn cung cấp nitrogen duy nhất. Bằng cách này, DNA được tổng hợp có 15N (15N là một chất phóng xạ nặng hơn chất phóng xạ thông thường 14N). Ở một thời điểm nhất định (thời điểm 0), các tác giả này đã chuyển nuôi cấy vào một môi trường chứa 14NH4Cl. Tiếp đến, sau từng thời gian đều đặn, họ phân tích DNA chiết xuất từ vi khuẩn bằng phương pháp ly tâm theo gradient CsCl. DNA được tách chiết và ly tâm để cân bằng theo grandient mật độ CsCl DNA nặng (15N) Các phân tử bố mẹ gốc H H Chuỗi mới Chuỗi mẹ DNA lai (15N/14N) Các phân tử con thế hệ thứ nhất H L L H DNA nhẹ (14N) DNA lai Các phân tử con thế hệ thứ hai L L H L L H L L Hình 4.1. Minh họa sự tái bản bán bảo thủ. Sơ đồ trình bày sự hợp thành các sợi đôi DNA sau 0, 1, và 2 vòng sao chép. H: chuỗi nặng (15N), L: chuỗi nhẹ (14N). Kết quả thực nghiệm cho thấy: - Ở thời điểm 0: chỉ có một phân tử tương ứng với DNA nặng 15N. Sinh học phân tử 77 - Sau một thế hệ trong môi trường chứa 14N: những phân tử DNA gồm một chuỗi nặng 15N (chuỗi mẹ) và một chuỗi nhẹ 14N (mới được tổng hợp). - Sau hai thế hệ trong môi trường chứa 14N: có hai phân tử lai (gồm một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ) và hai phân tử đều gồm những chuỗi nhẹ không có chuỗi nặng. II. Mô hình tái bản DNA-chạc ba tái bản 1. Mô hình tái bản Mô hình tái bản được nghiên cứu trên thể nhiễm sắc của vi khuẩn E. coli, DNA có dạng mạch vòng sợi đôi (Hình 4.2). Để tự tái bản DNA phải tháo ra đơn giản ở một vị trí nhất định và nơi đó xuất hiện chạc ba tái bản (Hình 4.3). Thí nghiệm của Cairns. Sử dụng nucleotide được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ trong môi trường đang phân chia, ta sẽ biết được tiến trình tái bản do hạt bạc xuất hiện dưới kính hiển vi điện tử. Sợi đôi của con Sợi đôi của bố mẹ Hình 4.2. DNA dạng mạch vòng sợi đôi. Chiều dài thực tế 1,6 mm (4,7×106 bp). 2. Chạc ba tái bản Hình 4.4 mô tả cấu trúc của chạc ba tái bản. Nhờ vào phương pháp phóng xạ ảnh tự ghi, người ta nhận thấy sự tái bản thực hiện theo hai hướng (bidirectional synthesis). Đồng thời cũng chứng minh được vi khuẩn E. coli (prokaryote) có duy nhất một điểm gốc tái bản, đó là điểm mà hai chuỗi xoắn kép của DNA mẹ được tách ra, tương ứng với hai chạc ba tái bản phát triển ngược chiều nhau. Chuỗi DNA sau khi tách ra được dùng làm khuôn mẫu cho sự tổng hợp DNA mới (Hình 4.5). Sinh học phân tử 78 A Chuyển động của chạc ba tái bản Gốc B Điểm đứt (nick) 1 Quay trong Hướng hướng cuộn cuộn Một điểm đứt được bịt kín, một điểm đứt khác được tạo ra Điểm đứt 2 Hình 4.3. Sự tái bản của phân tử DNA sợi đôi mạch vòng của E. coli. A: sự chuyển động không cuộn lại của các nhánh trong quỹ đạo tái bản, không có các vị trí quay tự do, gây ra sự cuộn lại quá chặt của phần không được tái bản. B: cơ chế sợi đơn bị đứt (nick) phía trước của chạc ba tái bản cho phép sự quay xảy ra. 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ (a) 3’ (b) (c) Hình 4.4. Sơ đồ cấu trúc của các chạc ba tái bản. (a): Chạc ba đơn trình bày sợi chủ (leading strand) được tổng hợp liên tục và sợi thứ (lagging strand) được tổng hợp gián đoạn. (b): Chạc ba đôi, phổ biến trong hầu hết mọi sự tái bản DNA của genome. (c): Các hướng hình học của sự tái bản DNA, mũi tên ngắn chỉ sự chuyển động dịch mã của chạc ba, mũi tên dài và cong chỉ sự quay vòng DNA cần thiết quanh các chạc ba. Sinh học phân tử 79 Sợi đôi bố mẹ không tái bản Hướng di chuyển của chạc ba tái bản Sợi con được tái bản Hình 4.5. Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử. Phân tử DNA mạch vòng nhỏ của E. coli có chiều dài thực tế 0,01 mm (3.000 bp) tái bản bằng kiểu θ. Các đoạn DNA bố mẹ và con được trình bày trong hình vẽ. Hình 4.6 so sánh sự khác nhau giữa tái bản DNA không định hướng và tái bản theo hai hướng. Trong tái bản không định hướng, chỉ có một chạc ba tái bản. Trong khi tái bản theo hai hướng yêu cầu hai chạc ba tái bản. Mũi tên cong chỉ hướng chuyển động của các chạc ba. Hầu hết DNA tái bản theo hai hướng. Gốc tái bản Tái bản chỉ trong một hướng Tái bản không định hướng Gốc tái bản Tái bản theo hai hướng Gốc tái bản Tái bản đồng thời trong cả hai hướng Chạc ba Chạc ba Gốc tái bản Chạc ba tái bản tái bản tái bản Hình 4.6. Tái bản DNA không định hướng và theo hai hướng Hình 4.7 và 4.8 mô tả phương thức hợp nhất các vòng tái bản DNA ở ruồi giấm (D. melanogaster). Quá trình tái bản diễn ra đồng thời trên hàng chục ngàn vị trí khác nhau của phân tử DNA và tạo thành các vòng tái bản, các vòng tái bản sau đó sẽ mở rộng theo hai hướng để cuối cùng hợp nhất với nhau tạo thành hai phân tử DNA. Sinh học phân tử 80 Hình 4.7. Hình ảnh dưới kính hiển vi điện tử của một đoạn nucleotide ở ruồi giấm. Phân tử DNA sợi đôi dài 30 kb cho thấy có 7 vòng tái bản. Sự tái bản bắt đầu và theo hai hướng Gốc tái bản Gốc tái bản Sự tổng hợp khởi đầu ở gốc thứ hai và cũng theo hai hướng Hình 4.8. Phương thức hợp nhất các vòng tái bản DNA của ruồi giấm. Hai gốc tái bản được trình bày trên hình vẽ, các mũi tên nhỏ chỉ hướng chuyển động của các chạc ba tái bản. 3. Tái bản DNA theo vòng tròn quay Trường hợp bacteriophage λ (thực khuẩn thể λ) có vật chất di truyền là một phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi, khi ta chuyển chúng vào vi khuẩn thì các đầu dính kết DNA (cos) của nó gắn lại theo dạng vòng tròn. Sự dính Sinh học phân tử 81 kết lại này là do hoạt động của enzyme DNA ligase giúp tạo lại dạng xoắn. Khi đó, sự tái bản DNA tiến hành theo cơ chế vòng tròn quay (Hình 4.9). Các nucleotide được bổ sung vào nhóm 3’-OH, chiếm chỗ của sợi Hướng quay có đầu tận cùng 5’-P Sự kéo dài tiếp tục của đầu 3’ 3’-OH 5’-P Nuclease cắt DNA tạo ra nhóm 3’-OH và nhóm 5’-P Hình 4.9. Tái bản vòng tròn quay ở bacteriophae Sợi có đầu tận cùng 5’-P cũng được sao chép . DNA được tổng hợp mới có màu nhạt. Sợi thay thế được tái bản trong các đoạn ngắn. III. Bản chất xoắn của DNA-Các giai đoạn của sự tái bản Hình 4.10 mô tả toàn bộ quá trình tái bản DNA. Quá trình này trải qua ba giai đoạn chính sau: 1. Mở xoắn Trước tiên ta thấy quá trình mở xoắn của hai sợi DNA cần thiết phải có một enzyme rất quan trọng đó là helicase (còn gọi là enzyme mở xoắn). Chẳng hạn, trên phân tử E. coli chỉ có một gốc tái bản (ký hiệu là ori C) dài 245 bp. Có ít nhất 8 enzyme hoặc protein tham gia vào giai đoạn khởi đầu của sự tái bản. Những enzyme-protein này mở xoắn DNA ở gốc ori C và thiết lập một phức hợp tiền mồi (prepriming complex) để chuẩn bị cho những phản ứng của giai đoạn sau. Một phức hợp khoảng 20 protein Dna A được kết hợp với một vùng của ori C bắt đầu cho quá trình mở xoắn và khởi đầu sự tái bản. Phản ứng này cần ATP và một protein giống như histone của vi khuẩn (HU). Tiếp đó, protein Dna C giúp protein Dna B gắn vào vùng ori C, Dna B chính là helicase sẽ mở xoắn DNA theo hai hướng để tạo ra hai chạc ba tái bản. Các phân tử protein liên kết sợi đơn (single stranded binding protein, protein SSB) gắn vào chuỗi đơn DNA để ổn định chuỗi này. Enzyme gyrase (DNA topoisomerase II) mở xoắn để tạo siêu xoắn trái ( ). Enzyme primase Sinh học phân tử 82 (protein Dna G) sẽ xúc tác tổng hợp RNA primer để gắn vào khuôn mẫu DNA. Kẹp Sợi chủ Polymerase III dimer Helicase Chạc ba tái bản DNA bố mẹ Khuôn mẫu sợi chủ Primase RNA primer Khuôn mẫu sợi thứ Các protein liên kết DNA sợi đơn (SSB) Ligase Polymerase I Đoạn Okazaki Hình 4.10. Quá trình tái bản DNA 2. Kéo dài-Tổng hợp chuỗi Okazaki Giai đoạn kéo dài bao gồm sự tổng hợp cùng một lúc hai chuỗi DNA. Một chuỗi được tái bản cùng hướng phát triển của chạc ba sẽ liên tục (sợi chủ), còn chuỗi kia sẽ không liên tục bao gồm các đoạn Okazaki (sợi thứ). Các nucleotide gắn vào đầu 3’ tự do, và kéo dài chuỗi ra nhờ enzyme DNA polymerase III theo chiều 5’ 3’. Trong giai đoạn này, nhiều enzyme đã tham gia vào sự tổng hợp hai chuỗi DNA tại chạc tái bản. DNA helicase tiếp tục tách hai chuỗi DNA mẹ, DNA gyrase mở xoắn, protein SSB ổn định những chuỗi DNA đơn đã được tách ra, DNA ligase gắn các đoạn Okazaki trên sợi thứ. -