Thu hồi và tinh sạch phytase tái tổ hợp có nguồn gốc từ Bacillus subtilis...

  • 16/09/2019 09:56:59
  • 26 lượt xem
  • 0 bình luận

  • Ít hơn 1 phút để đọc

Giới thiệu

Phytase là enzyme có ứng dụng quan trong trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi và chế biến thực phẩm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã cải tiến môi trường lên men LB và thu hồi được enzyme phytase BacP tái tổ hợp bằng phương pháp lên men theo mẻ chủng E. coli BL21(DE3) mang gen phyC tái tổ hợp.

Thông tin tài liệu

Loại file: PDF , dung lượng : 0.99 M, số trang : 10

Chi tiết

HNUE JOURNAL OF SCIENCE
DOI: 10.18173/2354-1059.2019-0015
Natural Sciences 2019, Volume 64, Issue 3, pp. 123-132
This paper is available online at http://stdb.hnue.edu.vn
THU HỒI TINH SẠCH PHYTASE TÁI TỔ HỢP NGUỒN GỐC
TỪ Bacillus subtilis TRONG DỊCH LÊN MEN Escherichia coli THEO MẺ
Trn ThThúyvà Mai ThNgc
Khoa Sinh học, Trường Đại học phạm Ni
Tóm tắt. Phytase là enzyme có ứng dụng quan trong trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn
nuôi và chế biến thực phẩm. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã cải tiến môi trường lên men
LB và thu hồi được enzyme phytase BacP tái tổ hợp bằng phương pháp lên men theo mẻ
chủng E. coli BL21(DE3) mang gen phyC tái tổ hợp. Enzyme BacP tái tổ hợp với hoạt độ
18,49 IU/mL thu được sau 18 gikích hot bng lactose, cao hơn so với vic sdng cht kích
hot biu hin isopropyl β-D-1-thio-galactopyranoside (IPTG). Bằng phương pháp sắc kí ái
lực kết hợp với cô đặc dịch lên men qua màng có kích thước lỗ 5 KDa, enzyme BacP đã được
tinh sạch 4,5 lần, đạt hoạt độ riêng 24,48 IU/mg protein. Nghiên cứu này là tiền đề cho việc
đánh giá khả năng sử dụng BacP, loại phytase kiềm có khả năng thủy phân phytate thành các
dẫn xuất inositol phosphate bậc thấp (IP2, IP3) có giá trị dược học, trong chế biến thực phẩm.
Từ khóa: Phytase, enzyme tái tổ hợp, lên men mẻ, Bacillus subtilis, Escherichia coli.
1.
Mở đầu
Phytase là enzyme xúc tác cho phn ng thy phân axit phytic thành myo-inositol phosphate
và các gốc phosphate vô cơ tự do. Dng mui ca axit phytic (các phytate) là dng dtr
phosphate chính yếu trong các hạt ngũ cốc (chiếm 1-3% hàm lượng cht khô ca ht) [1]. Đây
chính là nguyên nhân gây c chế quá trình tiêu hóa, làm gim khả năng hấp thcác chất khoáng
và protein ở cơ thể người và động vt [2, 3]. Chính vì vy, enzyme phytase đã được nghiên cu và
ng dng rộng rãi như một enzyme bsung vào thức ăn chăn nuôi nhằm tăng hiệu qukinh tế,
gim ô nhiễm phosphate trong môi trường đất và nước cho các trang trại chăn nuôi quy mô công
nghip, bán công nghip [4].
Căn cứ vào vị trí nhóm phosphate đầu tiên bị phytase tác động, Ủy ban danh pháp enzyme thuộc
Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế đã chia phytase thành hai nhóm: 3-phytase và 6-phytase [5]. Tuy nhiên,
trong thực tế ứng dụng, các đặc tính hóa , hóa sinh của enzyme lại được quan tâm nhiều hơn; do
vậy, người ta thường phân chia phytase thành phytase axit (Histidine Acid Phosphatase, HAP
phytase) và phytase kiềm (Beta Propeller Phytase, BPP phytase) [6]. Các HAP phytase (phytase từ
E. coli và nấm mốc Aspergillus sp.) được nghiên cứu khá nhiều
và được ứng dụng rộng rãi trong
chăn nuôi; tuy nhiên, các nghiên cứu về BPP phytase (phytase kiềm từ Bacillus sp. và từ phấn một
số loài hoa huệ tây) còn khá hạn chế [7, 8, 9], mc dù loại phytase này được cho là thy phân
phytate không hoàn toàn, to ra nhiu inositol phosphate bc thp (IP2, IP3) có li cho sc khe [10].
Ngày nhn bài: 12/3/2019. Ngày sa bài: 20/3/2019. Ngày nhận đăng: 27/3/2019.
Tác giliên h: Trn ThThúy. Địa che-mail: thuy_tt@hnue.edu.vn
123
Trn ThThúyvà Mai ThNgc
Phytase kiềm của cây hoa huệ tây (Lilium longixorum) đã được tinh sạch bởi Garchow và cs,
2006 [11]. Đầu tiên, dịch enzyme này được kết tủa bằng dung dịch (NH4)2SO4 với nồng độ bão
hòa 25 - 60% thu được enzyme với hoạt tính còn lại là 41,1 - 56,5%. Dịch thu được tiếp tục được
tinh sạch theo phương pháp sắc kí trao đổi ion bằng cột HiTrap Q-FF hoặc HiPrep (Amersham
Biosciences)
cuối
cùng
được
tinh
sạch
đến
đồng
nhất
bằng
sắc
lọc
gel.
Powar
Jagannathan, năm 1982, đã tinh sạch phytase từ dịch nuôi cấy Bacillus subtilis [12]. Dịch lọc lần
lượt được kết tủa bằng cồn ethanol và acetone, sau đó tiến hành sắc kí lọc gel bằng cột lọc
Amberlite IRP-64 và tinh sạch bằng sắc kí trao đổi ion DEAE-cellulose. Năm 1998, hai nhóm
nghiên cứu độc lập của Kerovuo J và Kim YO đã chuyển và biểu hiện thành công gen mã hóa
phytase kiềm trong Bacillus subtilis và tinh sạch được phytase kiềm tái tổ hợp (PhyC và TS-phy)
từ dịch lên men bằng sắc kí ái lực [7, 8].
Nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện trên phytase kiềm có nguồn gốc từ Bacillus subtilis
được biểu hiện trong E. coli BL21 (DE3), vật chủ được dùng phổ biến và có hiệu suất sinh tổng
hợp protein tái tổ hợp cao [13]. Phytase này mặc dù đã được Đỗ Thị Ngọc Huyền và cs (2007)
nghiên cứu tinh sạch một phần và xác định đặc tính nhưng chưa đánh giá được vai trò của các chất
kích hoạt trong toàn bộ quá trình lên men và thu hồi enzyme tái tổ hợp [14].
2.
Nội dung nghiên cứu
2.1.
Vật liệu phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Nguyên vật liệu
Chủng E. coli NB tái tổ hợp mang plasmid tái tổ hợp pE10C2 chứa gen phyC mã hóa phytase
từ Bacillus subtilis được tạo và lưu giữ tại bộ môn Công nghệ Sinh học - Vi sinh, Khoa Sinh học,
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội (Tran, 2010). Chủng E. coli BL21(DE3), dòng thường kí hiệu là
BL (Novagen, Mỹ) và dòng biến nạp nhanh (One-shot) kí hiệu là OS (Invitrogen, Mỹ) được dùng
để biểu hiện nguồn gen mã hóa phytase từ Bacillus subtilis; các dòng này được dùng để lên men,
sinh tổng hợp phytase tái tổ hợp (BacP).
Môi trường Luria Betani - LB (Difco), môi trường LBA (môi trường LB có bổ sung
ampicillin 100 mg/l). Các hóa chất: Tris-base (Sigma); axit axêtic, axit clohidric, natri hidroxit,
ethanol,
iso-propanol,
glyxerol,
canxi
clorua,
natri
clorua,
EDTA,
IPTG,
lactose,
glucose,
ammonium molypdate tricloroaxetic axit (Merck); natri-phytate (Sigma, P3168) đều tinh sạch ở
mức phân tích.
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
* Xác định hoạt tính enzyme phytase BacP
Hoạt tính enzyme phytase được xác định theo phương pháp của Shimizu, năm 1992 [15].
Lượng phosphate vô cơ (Pvc) giải phóng dưới tác dụng của phytase được xác định bằng dung dịch thử
màu, dung dịch có chứa 4 lần thể tích dung dịch A (1,5% amoniummolypdate (NH4)6Mo7O24 pha
trong dung dịch 5,5% H2SO4 ) và 1 lần thể tích dung dịch B (2,7% FeSO4.7H2O). So mầu trên
máy quang phổ tử ngoại khả kiến ở bước sóng 700 nm và định lượng Pvc trong dịch enzyme dựa
vào đồ thị chuẩn Pvc với hàm lượng NaH2PO4 từ 0,05 đến 1 mM. Một đơn vị hoạt tính phytase
(IU) được quy định là lượng enzyme để giải phóng 1 µmol Pvc trong 1 phút ở điều kiện thí
nghiệm.
* Biểu hiện enzyme BacP trong dịch nuôi cấy chng E. coli BL21(DE3) tái t hp
Chng E. coli BL21(DE3) tái thp mang gen phyC được hot hóa bng cách cy 1 khun
lc từ đĩa thạch giging 4-10vào đĩa thạch chứa môi trường LBA và nuôi trong t37ºC. T
mt khun lạc trên đĩa môi trường thch hot hóa cy vào 25ml LBA trong bình nón, thtích
100ml, nuôi lc 37ºC và 200 vòng/phút. Ging vi khuẩn đã hoạt hóa được bsung vào 200ml
124
Thu hồi tinh sạch phytase tái tổ hợp nguồn gốc từ Bacillus subtilis trong dịch lên men…
môi trường LBA lng trong bình tam giác 1000 ml sao cho OD620 ban đầu đạt 0,1; nuôi lc 37ºC
và 200 vòng/phút cho đến khi OD620 đạt giá tr1,0 -100 (Giai đoạn tăng sinh khối). Gen mã hóa
phytase được kích hot biu hin bng cách bsung cht cm ng - IPTG 1mM hoc lactose (1-
12,5 mM) và CaCl 10mM khi OD620 đạt giá tr1,0 100 (tùy thuc vào chiến lược lên men) và
nồng độ Pvc < 1mM. Ly mẫu (3 mL) định k1 gi/lần để kim tra khả năng sinh trưởng và sinh
tng hp phytase.
* Thu hi enzyme BacP t dch nuôi cy tế bào
Dch nuôi cy E. coli BL21(DE3) tái thp mang gen phyC được li tâm 8000 vòng/phút
trong 10 phút để thu dch ni (dch enzyme trong dch nuôi) và cn tế bào. Cn tế bào được hòa
trong dung dịch đệm 100mM Tris HCl pH = 7, 5mM CaCl2 vi thtích bng 1/10 thtích ban
đầu, đặt trong nước đá (0ºC) và đem phá tế bào bng sóng siêu âm vi âm tn 20kHz, lp li 4
vòng (mi vòng gm 1 phút siêu âm tmức 10 đến 50% công sut và 1 phút ngh). Dch phá tế
bào được li tâm thu dch ni (dch enzyme trong tế bào) và loi bcn là các mnh vtế bào.
* Tinh sch enzyme BacP
Enzyme
BacP được tinh sạch
bằng sắc ái lực IMAC (Immobilized metal affinity
chromatography). Cột sắc ái lực chứa hạt gel mang nhóm chức NTA (nitrilotriacetic acid) gắn
với Ni2+, protein tái tổ hợp chứa đuôi 6-His tag (đuôi 6 histidine) có khả năng tạo liên kết tĩnh điện
với ion kim loại Ni2+, giúp protein này được giữ lại trên hạt gel được chiết rút bằng lực ion khi
môi trường có chất cạnh tranh (imidazole) với đuôi 6-His tag ở nồng độ cao.
Quy trình tinh sạch gồm 05 bước: (1) Cân bằng cột bằng dung dịch đệm cân bằng cột
(100mM Tris HCl pH = 7, 300 mM NaCl, 5mM CaCl2, 1% Glycerol); (2) Gắn protein đích:
Mẫu protein enzyme (trong dung dịch 100mM Tris – HCl pH = 7, 5 mM CaCl2 và dung dịch đệm
cân bằng cột được trộn theo tỉ lệ thể tích 1 mẫu protein: 1 dung dịch đệm) được bổ sung vào cột;
(3) Rửa cột bằng dung dịch đệm cân bằng cột; (4) Chiết enzyme khỏi cột bằng dung dịch đệm
chiết enzyme (100mM Tris – HCl pH = 7, 300 mM NaCl, 5mM CaCl2, 1% Glycerol, 250mM
imidazol); (5) Cân bằng lại cột bằng dung dịch đệm cân bằng cột. Vận tốc dòng chảy trong suốt
quá trình tinh sạch là 1 mL/phút.
Protein tổng số trong dung dịch được xác định bằng phản ứng màu với coomasie brilliant
blue
[16].
Kích
thước
phytase
BacP
được
xác
định
bằng
điện
di
SDS-PAGE
trên
gel
polyacrylamide 12,5% (w/v) và vị trí của các băng vạch protein sẽ được hiển thị bằng cách nhuộm
bản gel trong dung dịch coomassie brillant blue [17]. Trọng lượng phân tử protein được xác định
bằng protein chuẩn của hãng Lonza.
2.2.
Kết quả thảo luận
2.2.1. Hoạt hóa, đánh giá lựa chn chng E. coli BL21(DE3) tái t hp mang gen
hóa phytase t Bacillus subtilis
Plasmid tái thp pE10C2 mang đoạn ADN ngoi lai (phyC) mã hóa phytase kim (BacP)
ca Bacillus subtilis được bo qun trong tế bào chtách dòng E. coli NB ca hãng Novagen.
Để phc vmục đích lên men, biểu hin gen trong E. coli, chúng tôi đã tách chiết, tinh sch
plasmid này tdch nuôi cy E. coli NB tái thp và biến np vào tế bào khbiến E. coli
BL21(DE3). Kết qubiến np vào hai dòng tế bào chE. coli BL21(DE3) khbiến BL và OS thu
được mt skhun lc to và tách biệt trên môi trường thch LB có cha kháng sinh ampicilin 100
µg/mL như một yếu tchn lc. Các khun lc mọc trên môi trường này đều là các khun lc
mang plasmid tái thp pE10C2, tuy nhiên, chúng tôi vn thc hin vic kim tra li scó mt
ca gen phyC trong mt sdòng tế bào được la chn ngu nhiên tcác khun lc mc tách bit
trên đĩa thạch môi trường LB có cha kháng sinh ampicilin 100 µg/mL bng phn ng PCR vi
cp mồi đặc hiu cho gen phyC. Kết quả điện di để kim tra snhân lên ca gen phyC trong phn
125

Download

capchaimage
Xem thêm
Thông tin phản hồi của bạn
Hủy bỏ